Isolation und Purifikation von mononukleären und epithlialen Zellen aus humanem Gewebe | Vorbereitung der Monolayerzellkultur für Versuche | Trypsinisierung der Zellen | Ermittlung der Zellzahl | Dichtegradientenzentrifugation | Einfrieren | Auftauen | Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) | Coomassie - Staining von Polyacrylamidgelen | FACS Analyse

 

Isolation und Purifikation von mononukleären und epithlialen Zellen aus humanem Gewebe

Kollagenase Sigma IV (Clostridium Histolyticum) 5 mg/ml Medium: RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, N. Y., U.S.A.) Fetales K”lberserum (FCS; SEBAK CmbH, Stuben, ÷sterreich) Penicillin/Streptomycin ( 10 000 IU/ml),1 Vol. "% (Gibco, Grand Island, N. Y. , U. S. A.) evtl. Lysepuffer zur Erythrozytenlyse: 0,829 g NH4C1 und 0,1 g KHCO3 auswiegen. Aqua dest ad l00 ml. Filtrieren. Für die Erythrozytenlyse muþ das Zellpellet in 3 - 5 ml Lysepuffer gut resuspendiert werden. Lysedauer: ca. 5 Min. Danach zweimal mit PBS waschen.

Vorbereitung: Pipetten, Sektionsbesteck, Petrischalen, mit Nylonnetzen (200mm) bespannte Bechergläser (10 bis 15 cm Durchmesser) - autoklaviert bzw. hitzesterilisiert Kollagenase in einer Konzentration von 5 mg/ml in RPMI/10 "% FCS/1 "% Penicillin-Streptomycin Menschliches Gewebe kann bei Strumektomien, eine häufig durchgefiihrte Operation, gewonnen werden. Vom Operationssaal wird es in sterile Röhrchen in RPMI, 10 "% FCS zum Labor transportiert. Das Gewebe spült man dann in einer Petrischale mit serumfreiem Medium und schneidet es in I bis 2 mm kleine Stücke. Das Ganze wird in eine sterile 100 ml Flasche gegeben, in der sich die gefilterte Kollagenaselösung befindet. Die Flasche muþ gut verschlossen werden (Schraubverschluþ plus Parafilm) und wird im 3'°C warmen Schüttel-Wasserbad zwei bis drei Stunden lang inkubiert. Wenn die Lösung trüb ist und die Gewebestückchen eine milchige Farbe angenommen haben, nimmt man die Flasche aus dem Wasserbad, schüttelt sie nochmals kräftig und filtert den Inhalt durch ein Nylonnetz in ein Becherglas. Anschlieþend transferiert man diese Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen, setzt serumfreies Medium zu und zentrifugiert bei ca. 1200 U/min 5 bis 10 Min. lang (mit Bremse). Das Zellpellet wird in frischem Medium gut resuspendiert und noch zwei mal gewaschen. Falls im Zellpellet viele Erythrozyten sind, kann man diese mit einem Lysepuffer entfernen. Die Inkubation der Zellen erfolgt in Medium (RPMI, 10% FCS, I% P/S) bei 37°C, 5% C02. Thyreozyten sind unter diesen Bedingungen stark adhärent. Sie haften an Plastikobetil”chen. Nach 16 stündiger Inkubation werden die Zellen in der Flasche gründlich mit serumfreiem RPMI gespült, womit kontaminierende Zellen, die durchwegs geringeres Adhärenzvermögen besitzen als Thyreozyten, entfernt werden.

 

Vorbereitung der Monolayerzellkultur für Versuche

Vor Versuchen müssen die Zellen vom Boden der Kulturschale entfernt und in Suspension gebracht werden. Dies kann durch Zugabe von Trypsin erfolgen. Trypsin ist ein eiweißverdauendes Enzym. Ziel ist es, die Zellen gerade soweit anzudauen, daß sie sich vom Boden des Kulturgefäßes lösen. Wenn man Oberflächenmarker nachweisen will, so sollte man die Zellen nicht zu lange mit Trypsin behandeln, um eine Zerstörung dieser Strukturen zu vermeiden.

 

Trypsinisierung der Zellen

Zuerst wird das Nährmedium abpipettiert. Anschließend wäscht man ein bis zwei mal mit serumfreiem, sterilem PBS um Serum, das die Wirkung des Trypsins inhibiert, zu entfernen. Nun gibt man pro Petrischale ca. 4,5 ml Trypsin zu. Das Trypsin sollte Körpertemperatur aufweisen, damit es optimal wirken kann. Nach 5 Min. Inkubation im Brutschrank, betrachtet man die Zellen im Invertmikroskop. Wenn sie sich von der Unterlage gelöst haben, wird die Reaktion mit 10% FCS (in diesem Fall: 0,5 ml FCS) gestoppt. Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenröhrchen transferiert, die Petrischale noch ein bis zwei mal mit PBS gespült und die Zellen bei 150O- U/min, 5 bis 10 Min. lang zentrifugiert.

Zellzählung und Aufteilung der Zellen in Kulturflaschen im Verhältniß 1:3-4 und Kultivation unter Normalbedingungen (37°C, 5% CO2).

 

Ermittlung der Zellzahl

Im Zellkulturlabor ist man ständig vor die Aufgabe gestellt, mit einer bestimmten Anzahl an Zellen zu arbeiten, deshalb an dieser Stelle das Prinzip der Zellzählung in sog. Zählkammern. Prinzip: Auf einem um 1/10 mm niedrigeren Mittelstreifen eines dicken Objektträgers ist Prinzip ein Netz von Linien in bestimmten Abständen eingeritzt. Durch Auflegen eines plangeschliffenen Deckglases entsteht ein Zwischenraum bekannter Größe, der mit Zellsuspension gefüllt wird. Die auf einer bestimmten Fläche des Netzes liegenden Zellen werden gezählt. Für die folgenden Versuche wurde die Zählkammer nach Bürker-Türk verwendet. Nach der Zentrifugation wird das Zellpellet in RPMI gut resuspendiert, mit Trypanblau verdünnt (z. B. 1:1-1:5) und in der Zählkammer ausgezählt. Die absolute Anzahl der Zellen erhält man nach folgender Formel: gezählte Zellen x Verdünnungsfaktor x 2 x 104 (Kammerkonstante aus Fläche und Kammertiefe). Trypanblau ist ein Farbstoff, der tote Zellen blau anfärbt (membrangängig). Dadurch hat man die Möglichkeit, den Anteil der lebenden Zellen zu erfassen (% Viabilität): (Zahl der lebenden Zellen x 100)/gesamte Zellzahl.

 

Dichtegradientenzentrifugation

Die Dichtegradientenzentrifugation beruht, wie der Name schon sagt, auf der unterschiedlichen Dichte von Zellen. FICOLL hat mit 1.077 eine größere Dichte als Lymphozyten und Monozyten. Diese Dichte ist jedoch kleiner als die von Erythrozyten und Granulozyten. Zur Separation gibt man in ein Universalröhrchen 7 bis10 ml FICOLL-Lösung welche vorsichtig mit derselben Menge heparinisierten Bluts überschichtet wird, sodaß sich die zwei Lagen nicht vermischen. Anschließend zentrifugiert man 30 Min. lang bei 2000 U/min ohne Bremse. Während der Zentrifugation wandern Erythrozyten, Granulozyten, Thrombozyten und tote Zellen auf den Boden des Röhrchens. Die mononukleären Zellen reichern sich in einer Schicht zwischen FICOLL und Plasma an. Diesen Lymphozytenring pipettiert man vorsichtig ab. Anschließend werden die isolierten Zellen zwei mal mit Nährmedium gewaschen (Zentrifugation bei 1300 bis 1500 U/min,10 Min. lang, mit Bremse).

Heparinblut nach der Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll. Schichtung: l. Serum, 2. Lymphozyten und Monozyten, 3. FICOLL, 4. Thrombozyten, Granulozyten und Erythrozyten.

 

Einfrieren

Beim Einfrieren von Zellen muß die Auskristalisation von Wasser im Zytoplasma verhindert werden. Es soll deshalb der Einfriervorgang auf Eis (4°C) durchgeführt werden. Der Zellpellet wird in Einfriermedium (50% RPMI, 40% FCS) resuspendiert. Danach wird tropfenwise DMSO (10%) zugesetzt und die Suspension in das auf Eis stehende Kryoröhrchen pipettiert. Danach entweder Styropor, Alhoholbox oder Einfriermaschine.

 

Auftauen

Zum Auftauen das Kryoröhrchen direkt aus dem Lager (-80°C oder N2) im Wasserbad (37°C) auftauen bis kein Eiskern mehr sichtbar und in ein vorbereitetes Röhrchen (50% RPMI und 50% FCS) pipettieren und Zentrifugieren. Zählen der Zellen, Waschen und entsprechend in Kulturgefäße aufteilen.

 

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

GELELEKTROPHORESE UND BLOTTING-TECHNIKEN:Methoden zur Analyse von Biomolekülen nach den Parametern Größe und sterischer, immunologischer, oder sequenzieller Spezifität.

Die linearisierten Proteine werden nun auf ein Gel aufgetragen. Zur Auftrennung von Nucleinsäuren werden standardmäßig Agarosegele, zur feinen Auftrennung Polyacrylamidgele verwendet. Für die Auftrennung von Proteinen werden meist Polyacrylamidgele [Acrylamid ist ein stark wirksames Neurotoxin und steht im Verdacht cancerogen zu sein] verwendet. Dann wird Spannung angelegt und geladene Molküle werden gleichsam durch das Gel "gezogen². Um die Trennung nach dem Parameter Größe durchführen zu können, ist es notwendig ein konstantes Masse:Ladungs-Verhältnis zu gewährleisten. Dies garantiert, daß alle Moleküle - unabhängig von ihrer Größe - die gleiche Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld aufweisen. Nucleinsäuren besitzen aufgrund ihrer chemischen Natur (Phosphatreste der Nucleotide) ein konstantes Masse:Ladungs-Verhältnis. Proteine haben kein konstantes Masse-zu-Ladungs-Verhältnis, da die Aminosäurereste unterschiedlich sind, d.h. die Auftrennung nach dem Parameter Größe würde durch einen weiteren Parameter beeinflußt.

2 Proteinspezies, die zwar eine gleiche Anzahl von Aminosäureresten besitzen, werden meist unterschiedliche isoelektrische Punkte aufweisen. Dieser Unterschied kann auch zur Auftrennung verwendet werden. In der Literatur wird oft die Isoelektrische Fokussierung (hauptsächlich für quantitative Trennung) oder aber 2D-Gelelektrophorese beschrieben. Die 2D-Gelelektrophorese ist verkürzt gesagt eine Trennmethode, die die Parameter Grösse und isoelektrischen Punkt in ihr Trennverfahren einbezieht.

Bei Proteinen wird ein konstantes Masse-Ladungs-Verhältnis dadurch hergestellt, daß die linearisierten Proteine mit dem anionischen Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) belegt werden, um die native Ladung (unterschiedlicher isoelektrischer Punkt verschiedener Proteinspezies) zu überdecken.

(SDS-PAGE ... Sodiumdodecylsulfate Polyacrylamid-Gelelectrophoresis) Die Auftrennung erfolgt durch das Gel, das als eine Art Filter, bzw. Netz fungiert. Die größeren Moleküle "verheddern" sich öfter in den Maschen des Netzes als kleiner; d.h. wenn die Spannung eine bestimmte Zeit angelegt wurde, werden kleine Moleküle weiter gewandert sein als große. Je nach molecule-of-interest (Zielmolekül) kann der Filter auf einen Größenbereich hin optimiert werden. Dies geschieht mittels Steigerung oder Minimierung des Gehalts von Agarose resp. Acrylamid im Gel (Prozentangaben der Gele) - in Analogie: Die Lücken in den Maschen des Netzes werden verkleinert oder vergrößert. Alle Moleküle mit gleicher Grösse ("Länge") befinden sich in einem eng begrenzten Bereich des Gels, den sog. Banden. Die Moleküle können nach erfolgter Auftrennung im Gel als sogenannte Banden visualisiert werden. Nucleinsäuren werden detektiert indem das Gel in einer Lösung mit Ethidiumbromid [aufgrund seiner interkalierenden Eigenschaften ist Ethidiumbromid stark mutagen und cancerogen] eingelegt wird. Ethidiumbromid lagert sich zwischen den Basenpaaren ein und kann dann unter Bestrahlung mit UV-Licht visualisiert werden.

Protein-Gele werden mit dem Farbstoff Coomassie Blue gefärbt, wenn man bei den Banden Proteinmengen im µg Bereich erwartet. Für den Nanogramm-Bereich steht eine Färbung auf dem Prinzip des Ausfällens von Silber - in Analogie zur Photographie - zur Verfügung (Silver Staining). Zur Bestimmung der Größen läßt man auf den Gelen Standards mitlaufen. Im Falle von Protein-Gelen ein Mix aus bekannten Proteinen unterschiedlicher Größe, im Falle der Trennung von Aminosäuren DNA-Fragmente bekannter Größe.

BLOTTING-TECHNIKEN: Mittels Gel-Elektrophorese werden Biomoleküle nach ihrer Größe aufgetrennt. Blots ermoeglichen es neben der Größe auch eine Information über die Spezifität des Moleküls in einer Bande zu erhalten. Die Moleküle bzw. Banden müssen dazu vom Gel auf eine Membran transferiert und dort immobilisiert werden. Als Membran dienen heute fast ausschließlich Kunststoff-Folien (PVDF, e.g.). Der Transfer erfolgt entweder über kapillare Saugwirkung oder aber über das Anlegen eines elektrischen Feldes, wodurch die Moleküle aus dem Gel auf die Membran "gezogen" werden. Proteine werden meist durch die Eigenschaften der Membran selbst genügend immobilisiert. Bei Nucleinsäuren kann man die Immobilisation gegebenfalls durch Einsetzen von UV-crosslinks verstärken.

Bei Nucleinsäuren detektiert man meist die Sequenzspezifität. Bei der Detektion durch Autoradiographie markiert man z.B. ein bekanntes DNA-Molekül durch Einbau radioaktiver (Phosphor) Nucleotide und verwendet dies als Sonde. Dieses Molekül wird nun an einen komplementären Strang binden. Die Akkumulation der Radioaktivität bei einer Bande, die einen der Sonde komplementären Nucleinsäurenabschnitt enthält, eine Schwärzung auf einem aufgelegten Film verursachen. Ist DNA das Zielmolekül spricht man von einem Southern-Blot (benannt nach Southern), ist RNA das Zielmolekül handelt es sich um einen Northern-Blot. Southern Techniken kommen u.a. bei der Charakterisierung von Genen zum Einsatz. Das Äquivalent zur Histochemie bei N- und S-Blot stellt die ISH (in-situ Hybridisierung) dar (FISH ... Fluorescent in-situ Hybridisation). Beim Western-Blot stellt das Zielmolekül ein Protein dar. Als Sonden werden meist Antikörper oder Antikörperfragmente verwendet. Antikörpern können je nach Spezifität Aminosäuresequenzen oder räumliche Determinanten erkennen. Wie bei der Histochemie fungiert dieser primäre Antikörper nur zur Feststellung der Spezifität, aber nicht direkt zur Detektion. Zur Detektion wird ein sekundärer Antikörper, der den primären Antikörper bindet verwendet. Der sekundäre Antikörper ist entweder radioaktiv markiert oder trägt ein Enzym (Horse Radish Peroxidase ([Meerrettichperoxidase] oder Alkaline Phosphatase), welches eine Reaktion, die als Endprodukt einen Farbstoff oder chemiluminescenten Stoff hervorbringt, der dann die Bande wieder auf einem aufgelegten Film visualisiert, katalysiert. Während die Histochemie es erlaubt, die Lokalisation von Proteinen in Geweben, bzw. bestimmten Zelltypen und in geringerem Maß auch die Lokalisation in der Zelle darzustellen, ermöglicht der Western-Blot eine semi-quantitative Analyse des Niveaus der Proteinproduktion in einem Gewebe oder in einem Zelltyp (je nach Ausgangsmaterial) zu einem bestimmten Zeitpunkt. (Der N-Blot erlaubt die eine semi-quantitative Analyse des Niveaus der Transkription einer bestimmten mRNA-Spezies).

Dem Western-Blot verwandte Methoden sind ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), EIA (Enzymatic Immuno Assay) und RIA (Radioactive Immunoassay). Bei diesen Methoden kann allerdings auch semi-quantitative Information nach dem Parameter Spezifität des Zielmoleküls gewonnen werden. Wenn die Information über die Größe eines Moleküls in einem Experiment überflüssig ist, gibt es dennoch einen Grund, der für die Anwendung der an sich aufwendigeren Technik W-Blot spricht: In einer Bande auf einem Gel erreicht man schnell und einfach eine detektierbare Konzentration von Zielmolekülen; denn eine Probenaufbereitung die detektierbare Mengen in EIA o.ä. liefert, ist oft aufwendiger als SDS-PAGE und W-Blot, und natürlich bekommt man die Gösseninformation und damit mehr Sicherheit mitgeliefert (vgl. Diagnose von HIV ist nur zulässig, wenn ELISA und Western-Blot positiv sind).

 

Coomassie - Staining von Polyacrylamidgelen

Die zu färbenden Gele werden für mindestens eine halbe Stunde in Coo-massie-Färbelösung unter Schwenken gebadet und zum Entfärben in Ent-färbelösung unter mehrmaligen Wechseln der Lösung geschwenkt.

Beim Färben wird die Schale mit dem Gel auf die Heizplatte gestellt. Der Entfärbeprozeß kann so auch beschleunigt werden.

Zur Konservierung der Gele werden diese zwischen 3 MM-Filterpapier und Frischhaltefolie mindestens 45 min bei 80°C in einem heizbaren Geltrockner (Pharmacia) getrocknet.

 

FACS Analyse

Die Abkürzung FACS bedeutet Fluorescence Activated Cell Sorter und ist von der Funktionsweise her ein Durchflußzytometer. Durchflußzytometrie kann allgemein als eine Technik bezeichnet werden, bei der man jene physikalischen Signale mißt, die man erhält, wenn Partikel in einem Flüssigkeitsstrom durch einen Lichtstrahl geleitet werden. Dabei kann jede einzelne Zelle bezüglich mehrerer Parameter gleichzeitig untersucht werden. Voraussetzung für die Arbeit mit dem Durchfluþzytometer ist, daß Zellsuspensionen vorliegen. In dieser werden die Zellen zuerst mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert und dann über eine Kapillare aus dem Röhrchen in das Durchfluþzytometer angesaugt und anschließend in einer isotonen Lösung so aufbereitet, daß sie hintereinander durch eine Fließkammer strömen. Sie werden dabei an einem Laserstrahl vorbeigeleitet. Das auftreffende Licht wird in unterschiedliche Richtungen abgelenkt. Vorwärts gestreutes Laserlicht bezeichnet man in der Fachsprache als "FORWARD SCATTER" ("FSC"). Dieses Signal liefert eine Auskunft ¸ber die relative Größe der Zelle. Im rechten Winkel abgelenktes Licht ist der sog. "SmE SCATTER" ("SSC") und ist ein Maß für die Oberflächenbeschaffenheit bzw. Granularität. Der dritte wichtige Parameter ist die Fluoreszenz. Durch das Laserlicht werden die Elektronen des Fluoreszenzstoffes auf ein höheres Energieniveau gehoben. Da dies jedoch ein instabiler Zustand ist wird beim Zurückkehren der Elektronen in den ursprünglichen Zustand Energie und somit Licht frei. Dieses emittierte Licht ist energieärmer als das Anregungslicht und hat eine größere Wellenlänge. Streu- und Fluoreszenzlicht werden in einem getrennten System zu Photodetektoren gelenkt. Diese wandeln die Lichtblitze in Impulse um, welche schließlich im Computer gespeichert werden.

Zellen die das nachzuweisende Antigen exprimieren un in der Folge mit dem fluoreszenzmarkierten Anrtikörper gefärbt wurden, sind "positive" Zellen. Die sog. "mittlere Fluoreszenzaktivität (MFI)" gibt einen Überblick über die Stärke der Expression der untersuchten Moleküle auf den Zellen. Wenn das nachzuweisende Molekül auf den Zellen nicht vorhanden ist, so sind die Zellen in bezug auf diese Struktur "negativ". Um festzulegen, ab wann ein Fluoreszenzsignal a1s "positiv" zu bewerten ist muþ man Kontrollexperimente durchführen. Als Negativkontrolle kann man z. B. ungefärbte Zellen verwenden. Sie sind ein Maß für die Autofiuoreszenz. Darunter versteht man jene Hintergrundfluoreszenz die vor allem durch diverse intrazelluläre Bestandteile verursacht wird, welche ebenfalls durch das Laserlicht angeregt werden. Granulierte Zellen sowie in vitro kultivierte Zellen zeigen eine höhere Autofluoreszenz. Bei Verwendung indirekter Färbemethoden, bei denen ein unkonjugierter Antikörper zur Verwendung kommt, werden Zellen, die ausschlieþlich mit dem fiuoreszenzmarerten Zweitantikörper inkubiert wurden, als Negativkontrolle verwendet. Die am häufigsten eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe sind Fluoreszinisothiocyanat (FITC) und Phycoerythrin (PE). Beide Substanzen werden von blauem Lase zur Fluoreszenz angeregt. Sie haben aber unterschiedliche Emissionsspektren. Je nachdem wieviele Antikörper am Nachweis eines Oberflächenmoleküls beteiligt sind, spricht man von direkter bzw. indirekter Immunfluoreszenzfärbung. Bei der zuerst genannten Methode ist der gegen das gesuchte Antigen gerichtete Antikörper mit dem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Die Detektion der gesuchten Struktur und die Sichtbarmachung der Antigen-Antikörperbindung erfolgt in einem Schritt. Für die indirekte Methode hingegen, verwendet man zwei Immunglobuline verschiedener Spezies. Der erste Antikörper ist nicht markiert. Er bindet an das gesuchte zelluläre Antigen. Mit einem zweiten fluoreszenzmarkierten Antikörper, der gegen den ersten gerichtet ist, wird der Immunkomplex nachgewiesen. Die direkte Immunfluoreszenz ist zeitersparend. Auþerdem eignet sie sich gut für Doppelfärbungen. Die konjugierten Antikörper sind jedoch nicht so lange haltbar wie unkonjugierte, da die Fluoreszenz mit der Zeit abnimmt. Die indirekte Methode erfordert einen größeren Zeitaufwand, hat aber den Vorteil, daß die unkonjugierten Erste-Lage-Antikörper länger haltbar sind. Auþerdem kann man mit einem konjugierten Zweite-Lage-Antikörper mehrere Erste- Lage-Antik–rper verschiedener Spezifität nachweisen. Verwendet man z. B. als zweite Lage ein anti-Maus-Immunglobulin, so kann es zum Nachweis von jedem Maus-Antikörper verwendet werden. Auþerdem erreicht man mit der indirekten Methode eine Verstärkung des Fluoreszenzsignals da die meist polyklonalen Zweite-Lage-Antikörper an mehrere Epitope des Erstantikörpers binden. Die konjugierten Antikörper hingegen, die bei der direkten Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden sind meistens monoklonale Antikörper und binden somit nur an ein spezifisches Epitop. Für ein optimales Ergebnis ist es notwendig, die verwendeten Immunglobuline in der richtigen Konzentration einzusetzen. Zu diesem Zweck titriert man das Reagenz aus, d.h. der Antikörper wird in verschiedenen Verdünnungen (z.B. 1: I 0 bis 1:1000) ausgetestet. Anschlieþend vergleicht man die aus den einzelnen Färbungen resultierende MFI und wählt die höchste Antikörperverdünnung aus, die noch ein deutliches Fluoreszenzsignal bewirkt.